Start von Cape Canaveral (KSC) und Landung in Cape Canaveral (KSC), Runway 33.

STS-75 hob pünktlich von der Startrampe ab, aber nach weniger als einer Minute Flugzeit wurde im Cockpit der Columbia für das Triebwerk Nr. 2 nur noch eine Schubkraft von 45 % statt der üblichen 104 % angezeigt. Die Bodenkontrolle konnte das nicht bestätigen; dort wurde die nominale Schubkraft angezeigt. Beim planmäßigen Drosseln der Triebwerke auf 67 % fiel die Anzeige im Cockpit sogar auf 5 %. Im Falle eines realen Schadens am Haupttriebwerk wäre bei einer Flugzeit von nur einer Minute ein RTLS-Abort, also eine Rückkehr zum Startplatz, unvermeidlich gewesen.

Wesentliche Missionsaufgaben waren der Wiederholungsflug des Fesselsatelliten TSS (Tethered Satellite System) nach der erfolglosen Mission STS-46 sowie der Betrieb der (USMP) US Microgravity Payload-3.

Die Besatzung bestand in größeren Teilen aus der Mannschaft der erfolglosen Mission STS-46. Neben Andrew Allen (diesmal als Kommandant) waren auch die Missionsspezialisten Jeffrey Hoffman, Franklin Chang-Diaz und Claude Nicollier wieder an Bord. Der italienische Nutzlastspezialist Franco Malerba war von der ASI durch seinen Ersatzmann Umberto Guidoni ersetzt worden.

Analog zu den Spacelab-Flügen wurde die Mannschaft in Schichten eingeteilt. Erstmals kam bei STS-75 ein Drei-Schicht-System zur Anwendung. Das rote Team wurde von Pilot Scott Horowitz angeführt. Ihm zur Seite gestellt waren Maurizio Cheli und Umberto Guidoni. Das blaue Team bestand aus Jeffrey Hoffman, Claude Nicollier und Franklin Chang-Diaz. Das weiße Team setzte sich aus Kommandant Andrew Allen und Jeffrey Hoffman zusammen. Es war vorrangig für die TSS-Operationen zuständig und wurde später aufgelöst. Danach passte Andrew Allen seine Zeiten immer mehr dem roten Team an.

Im Mittelpunkt der Mission standen aber der zweite Test des Fesselsatelliten TSS (Tethered Satellite System, Masse etwa 700 kg) zur Entwicklung neuer Energiequellen und neuer Methoden, die obere Erdatmosphäre zu erforschen, sowie Arbeiten zur Gewinnung neuer Materialien und eines besseren Verständnisses für bestimmte physikalische Phänomene. Es wurden zunächst verschiedene Anlagen des Fesselsatellitenexperimentes probeweise in Betrieb genommen. Dabei traten schwerwiegende Computerprobleme auf, die durch das Auswechseln eines Kabels und mehrere Neustarts der beteiligten Systeme aber behoben werden konnten. Einen Tag später als geplant wurde der auf einer Spacelab-Palette montierte 11,3 Meter hohe Haltemast aufgerichtet und der Satellit aus der Ladebucht entlassen. Dabei wurde ein kunststoffummanteltes Kupferkabel abgerollt. Der Satellit besaß einen eigenen Stickstoff-Antrieb, mit dem er vom Shuttle weg manövriert wurde. Geplant war ein Ausrollen auf 20,7 Kilometer für 22 Stunden und danach ein stufenweises Einrollen mit mehreren Zwischenstopps für ausgiebige Plasmamessungen. Das Haltekabel riss allerdings nach etwa 5 Stunden kurz vor dem Erreichen der maximalen Länge. Bis dahin hatten die Messungen eine maximale Spannung von 3500 Volt und eine maximale Stromstärke von 480 Milliampere ergeben. Die zurückgeschickten Elektronen erreichten mit 10 keV die zehnfache Ausgangsenergie, die Beschleunigungswerte an Bord des Satelliten waren geringer als ein Tausendstel der Erdbeschleunigung (0,0009 g). Nach dem Austreten aus den Metallspitzen der Elektronenkanonen dehnte sich die Elektronenwolke in Abhängigkeit vom Potenzial des Orbiters, von der lokalen Ionosphärendichte und der Strahlrichtung zu einem Zylinder aus. Am sechsten Flugtag wurden per Funkbefehl weitere Apparaturen aktiviert, sodass auch Daten über die obere Atmosphäre gesammelt werden konnten. Dazu gehörten Ionen- und Elektronendichtebestimmungen sowie Messungen der elektrischen und magnetischen Feldstärken. Die Messergebnisse wurden solange übermittelt, bis die Batterien des Satelliten erschöpft waren. Trotz des Verlustes brachte TSS eine Vielzahl wertvoller Daten. Dabei zeigte sich, dass die Energiegewinnung durch einen Fesselsatelliten weitaus effektiver war, als theoretische Modelle vorausgesagt hatten.
Die TSS-Ingenieure diskutierten über eine Möglichkeit, den Fesselsatelliten durch ein Rendezvous-Manöver einzuholen und zu bergen. Die Columbia würde während der weiteren Mission TSS noch zweimal direkt "unterfliegen". Der Plan wurde jedoch verworfen, weil er mit erheblichen Risiken behaftet war. Zum einen hatte der Fesselsatellit weiterhin etwa 20 Kilometer Seil im Schlepptau. Andererseits rotierte er und hatte keine Haltegriffe. Außerdem hatte er wegen leerer Stickstofftanks nur noch sehr begrenzte Manövrier-Möglichkeiten.

An Bord von STS-75 flog die US Microgravity Payload-3 mit mehreren Experimenten auf verschiedenen wissenschaftlichen Gebieten. So wurden Kristalle aus Blei-Selen-Tellurid in einem speziellen Schmelzofen hergestellt (AADSF). Gleichzeitig wurden die minimalen Beschleunigungen gemessen, die durch die Bremswirkung der Atmosphäre und die Bewegungen der Astronauten hervorgerufen werden (SAMS/OARE). Zweck der Untersuchungen war es, festzustellen, welchen Einfluss diese minimalen Störungen auf ein gerichtetes Kristallwachstum haben. Der Erstarrungsprozess geht dabei sehr langsam vor sich. Die Apparatur besitzt mehrere Zonen, in denen die Temperatur zwischen 340 und 870 °C variiert werden kann. Blei-Selen-Tellurid ist ein Halbleitermaterial, das für die Herstellung von Infrarot-Detektoren und Lasern verwendet wird.

MEPHISTO war die Bezeichnung für eine Apparatur, mit dem interessante Erstarrungsphänomene parallel auf der Erde und in der Schwerelosigkeit studiert wurden. Dabei ging es um den Einfluss gravitationsabhängiger Konvektion und Sedimentation auf die Herstellung von Metallen und Metalllegierungen. Während der STS-75-Mission wurden drei Zinn-Wismut-Kristalle gezogen. Dabei wurde die Form der Erstarrungsfront durch Stromimpulse sichtbar gemacht. Ebenfalls zur Festkörperforschung gehörte das Isothermal Dendrite Growth Experiment (IDGE). Ein Material (SCN = Succinonitrile), das beim Erstarren ein ähnliches Verhalten zeigt wie Metalle, jedoch durchsichtig ist, wurde durch Abkühlung zum Erstarren gebracht. Dabei entstanden baumartige Auswüchse, sogenannte Dendrite. Deren Form lässt Aussagen über den Ablauf der Erstarrung zu, die mit Video- und Filmkameras aufgezeichnet wurden.

Ebenfalls gefilmt wurde das Verhalten kleiner Xenonwolken am kritischen Punkt. Der kritische Punkt ist ein Zustand, an dem die Grenze zwischen flüssig und gasförmig verschwindet. Xenon ist im gasförmigen Zustand durchsichtig und als Flüssigkeit weißlich. Mit Hilfe reflektierten Laserlichtes konnten Größe und Form der flüssigen Teilbereiche genau beobachtet werden. Beim Critical Fluid Light Scattering Experiment, das man nach einem griechischen Philosophen der Antike Zeno nannte, wurden Aussagen zum Verlauf von Zustandsänderungen und zur Veränderung magnetischer Eigenschaften präzisiert.

Ansonsten widmete sich die Mannschaft den Mikrogravitations- und Verbrennungsexperimenten. So wurden Kristalle aus Blei-Selen-Tellurid in einem speziellen Schmelzofen hergestellt (AADSF). Gleichzeitig wurden die minimalen Beschleunigungen gemessen, die durch die Bremswirkung der Atmosphäre und die Bewegungen der Astronauten hervorgerufen werden (SAMS/OARE). Zweck der Untersuchungen war es, festzustellen, welchen Einfluss diese minimalen Störungen auf ein gerichtetes Kristallwachstum haben. Der Erstarrungsprozess geht dabei sehr langsam vor sich. Die Apparatur besitzt mehrere Zonen, in denen die Temperatur zwischen 340 und 870 °C variiert werden kann. Blei-Selen-Tellurid ist ein Halbleitermaterial, das für die Herstellung von Infrarot-Detektoren und Lasern verwendet wird.

Im Mitteldeck wurden außerdem drei Experimente zur Untersuchung von Verbrennungsprozessen in der Schwerelosigkeit durchgeführt. Sie befanden sich in einer sogenannten Handschuhbox und waren hermetisch von der Umgebung abgeschlossen. Erforscht wurde die Ausbreitung von Flammen in Abhängigkeit von Luftströmung und Temperatur (FFFT), das Entzünden von aschefreiem Filterpapier durch Wärmestrahlung (RITSI) und die Entstehung von Ruß, seine Verteilung und Bewegung in quasistationären Flammen. Dazu wurden verschiedene Brandherde untersucht, von einer normalen Kerzenflamme über Papier und Isolationsmaterial bis hin zu Teflon und Kapton (CSD). Wie bei nahezu jedem Shuttle-Flug befand sich auch bei dieser Mission eine Anlage zur Herstellung reinster Proteinkristalle für die medizinische Forschung an Bord (CPCG). Mit 9 Proben neuer Therapeutika gegen Infektionen, Krebs und Hormonstörungen wurde eine neue Dampf-Diffusions-Apparatur zur Proteinkristallisation eingeweiht.

Die Missionsdauer wurde wegen schlechten Wetters über dem KSC um einen Tag verlängert. Dort hatte eine dichte Wolkendecke und starke Winde eine Landung der Columbia verhindert. Am folgenden Tag konnte die erste Landemöglichkeit in Florida nicht genutzt werden, weil die Wolkendecke immer noch zu dicht war.