STS-54 startete von Cape Canaveral (KSC). Auch die Landung erfolgte in Cape Canaveral (KSC), Runway 33. Der Start hatte sich wegen technischer Probleme um siebeneinhalb Minuten verzögert. Die Manager erteilten die Startfreigabe trotz etwas zu starker Höhenwinde.

Hauptnutzlast war der fünfte Datenrelaissatellit (TDRS-F) der TDRS-Reihe (Tracking and Data Relay Satellite). Schon kurz nach dem Start und dem Öffnen der beiden Ladebuchttore lösten Mario Runco und Susan Helms die vorderen Halterungen von TDRS-F und kippten den Ring, in dem die IUS-Oberstufe montiert war, um 29 Grad nach oben. In dieser Position konnten in den nächsten Stunden nun Kommando- und Kommunikationschecks durchgeführt werden. Nach dem zufriedenstellenden Abschluss der Tests betätigte Mario Runco einen Schalter, mit dem die letzten Verbindungsleitungen zum Satelliten gekappt wurden. Danach brachte er TDRS-F in seine endgültige Aussetzposition von 59 Grad über der Ladebucht. Eine Reihe von starken Federn schoben das 17.350 kg schwere TDRS/IUS-Gespann mit einer Geschwindigkeit von 107 mm/s aus der Ladebucht heraus. Der Satellit schwebte über die Kabine der Endeavour hinweg. Direkt nach dem Aussetzen brachten John Casper und Donald McMonagle die Endeavour von der bisherigen fast kreisförmigen Bahn in 296 km in einen 330 x 302 km messenden elliptischen Orbit, um zum Zeitpunkt der IUS-Zündung genügend Abstand zu haben. Außerdem drehten sie den Orbiter mit der Unterseite zu TDRS-F, um die Fenster vor den Abgasen zu schützen. Mit zwei Zündungen brachte die IUS-Oberstufe den Satelliten in die geostationäre Umlaufbahn in 39.910 km Höhe.

Die wichtigste Aufgabe des dritten Flugtages war eine Physikstunde, die an mehr als 1.200 Schulen in den Vereinigten Staaten live verfolgt werden konnte. Vier Schulen hatten sogar eine Up-Link-Verbindung mit dem Orbiter, konnten also den Astronauten auch Fragen stellen. Die Astronauten zeigten u.a. wie sich verschiedene Spielzeuge unter Schwerelosigkeit verhalten. Mario Runco zeigte, wie ein Auto durch die Zentrifugalkraft auf einem Looping gehalten wurde. Als er die Fahrbahn öffnete, sauste das Auto in einer geraden Linie fort.

Die einzige EVA während des Fluges von STS-54 unternahmen Gregory Harbaugh und Mario Runco am 17. Januar 1993 (4h 28m). Dabei wurden Übungen für den Aufbau einer Raumstation durchgeführt. Während Gregory Harbaugh auf der Backbordseite der Ladebucht entlang sich vom hinteren Ende nach vorn zum Cockpit hangelte, tat Mario Runco das gleiche auf der Steuerbordseite. Im Gegensatz zu Mario Runco, der frei von irgendwelchen Ausrüstungsgegenständen war, musste Gregory Harbaugh aber einen Satz von Werkzeugen in der sogenannten "Mini Work Station" mitschleppen. Zur Fortbewegung dienten die Haltegriffe entlang der beiden Ladebuchtseiten. Die nächste Übung bestand für Gregory Harbaugh darin, den "Aft Frame Tilt Actuator" (AFTA), ein Gerät zum manuellen Drehen des Rings, der am ersten Flugtag den TDRS-Satelliten gehalten hatte, am Ring selbst anzubinden. Die Schwierigkeit dabei lag darin, dass Gregory Harbaugh diese Arbeit freischwebend - also ohne Fußhalterungen oder Handgriffe - erledigen musste. In der Zwischenzeit versuchte Mario Runco herauszufinden, wie schwierig es ist, beim Anziehen einer Schraube sich selbst zu stabilisieren. Danach hatte Mario Runco die Aufgabe, sich mit Hilfe von zwei Seilen ohne Haltegriffe zu benutzen in eine tragbare Fußhalterung ("Portable Foot Restraint" - PFR) zu katapultieren. Dazu benutzte er die Seile als Zügel, brachte sich über die PFR und zog sich dann über den Steigbügel hinunter. Im nächsten Versuch mussten die beiden Astronauten zusammenarbeiten. Es ging darum festzustellen, wie schwer oder leicht der Austausch von Geräten z.B. beim Hubble Space Telescope zu bewerkstelligen ist. Hierzu musste ein Astronaut jeweils den Kollegen entlang des Ladebuchtrandes schleppen. Die Männer kamen zu dem Ergebnis, dass bei Arbeiten im Weltraum die natürliche Grenze des menschlichen Leistungsvermögens erreicht ist, wenn eine Masse von 200 kg mit einer Hand gehalten werden soll, während man sich mit der anderen Hand vorwärtsbewegen soll.

STS-54 nahm auch eine neue Toilette ("Waste Collection System" - WCS) mit ins All. Die neue Toilette besitzt einen Verdichter, während die alte Version die Exkremente lediglich sammelte. Daneben sind auch neue Motoren, Ventilatoren und Dichtungen eingebaut, die gewährleisten, dass der Abfall unter Schwerelosigkeit wirklich wie Wasser auf der Erde abgeführt wird.

Ein weiterer Schritt auf dem Weg zu Langzeitmissionen, bei denen der Orbiter an eine Raumstation angedockt ist, war die Abschaltung und das Wiederstarten einer von drei Brennstoffzellen. Diese Prozedur wird erforderlich sein, weil die Stromversorgung eines angedockten Shuttles von der Raumstation selbst übernommen werden soll.

Daneben gab es noch folgende Experimente an Bord: das "Diffuse X-ray Spectrometer" (DXS), mit dem Daten über die Röntgenstrahlung diffuser Quellen im Weltall aufgezeichnet wurden, und das sich zu Beginn der Mission selbständig aufgrund eines technischen Problems ausschaltete, später aber einwandfrei funktionierte, der "Commercial General Bioprocessing Apparatus" (CGBA), das "Chromosome and Plant Cell Division in Space Experiment" (CHROMEX) zum Studium des Pflanzenwachstums, das "Physiological and Anatomical Rodent Experiment" (PARE) zur Untersuchung des Skeletts und dessen Anpassung an die Schwerelosigkeit, das "Space Acceleration Measurement Equipment" (SAMS), um die Gravitationskräfte im erdnahen Raum zu messen sowie das "Solid Surface Combustion Experiment" (SSCE) zur Messung der Ausbreitungsrate und Temperatur von brennendem Filterpapier.

Die erste Landemöglichkeit im Kennedy Space Center konnte nicht genutzt werden, weil sich während der Nacht zu viel Nebel gebildet hatte, der die Sicht auf die Landebahn verhinderte. Nach Sonnenaufgang löste sich der Nebel aber auf, sodass der Landung im KSC nichts mehr im Wege stand.