Start von Cape Canaveral (KSC) und Landung auf der Edwards AFB, Runway 22.

Nach der Columbia-Katastrophe wurden Pläne für die Rettung einer Besatzung entwickelt, deren Shuttle nicht länger zum Wiedereintritt fähig war. Es wurde ein als Contingency Shuttle Crew Support (CSCS) bezeichnetes Profil mit der allgemeinen Missionsbezeichnung STS-3xx entwickelt, bei welchem die Crew auf die Internationale Raumstation evakuiert wird und dort auf ein Rettungsshuttle wartet. Dieses Profil setzt jedoch voraus, dass die Umlaufbahn der Internationalen Raumstation, welche eine Bahnneigung von 51,6° hat, das Flugziel der zu rettenden Mission ist. Diese Voraussetzung ist für eine Hubble-Wartungsmission mit einer Bahnneigung von 28,5° nicht gegeben und lässt sich auch nicht nachträglich durch Bahnmanöver erreichen. Entsprechend ließ die NASA weitere Hubble-Flüge vorerst fallen. Nachdem jedoch Wissenschaftler Druck auf die NASA ausübten, Hubble erneut anzusteuern, begann man nach einer ISS-unabhängigen Alternative zu suchen. Man entwickelte einen, auf mehreren Weltraumausstiegen in ein rasch gestartetes Rettungs-Shuttle basierenden, Plan, welcher als STS-400 den Missionsregeln für STS-125 beigefügt wurde. STS-125 ist somit die einzige Mission für die ein spezieller Rettungsplan erarbeitet wurde. Die Rolle des Rettungsshuttles hätte die Endeavour übernommen.

STS-125 (HST-SM-04) war der fünfte Wartungsflug zum Hubble-Weltraumteleskop. Während der Wartungsmission SM4 (Service Mission 4) wurden im Rahmen von fünf Weltraumausstiegen alle drei Rate Sensor Units mit je zwei Gyroskopen (Einrichtungen zur Lageregelung des Teleskops) sowie die zwei Akkus ausgewechselt. Außerdem wurde ein neuer Sensor zur genauen Ausrichtung des Teleskops auf Himmelsobjekte installiert. An verbesserten Forschungsgeräten wurden eine neue Kamera und ein neues Spektrometer eingebaut. Durch den Erfolg dieses Reparaturfluges gilt der Betrieb des Hubble-Teleskops bis mindestens ins Jahr 2014 als gesichert.

Während des Aufstiegs zeigte ein Sensor an einem der Triebwerke falsche Werte an. Das Kontrollzentrum in Houston wies die Besatzung an, diese zu ignorieren, da sie die Triebwerkseffektivität nicht beeinträchtigten. Im Fall eines Kommunikationsverlustes während der Startphase hätte die Crew diese Werte als Indikator für einen Abbruch verwenden können. An dem Flammableitkanal der Startanlage wurde eine gut 2 Quadratmeter große Fläche und einige Gasleitungen für Stickstoff bzw. Druckluft beschädigt. Der Terminplan für Endeavour war durch die nötigen Reparaturarbeiten nicht gefährdet.

40 Minuten nach dem Start wurde die erste Triebwerkszündung, der OMS-2-Burn durchgeführt, welcher den Orbit der Raumfähre erhöhte und stabilisierte. Eine Stunde später wurden die Ladebuchttüren geöffnet. Einige Zeit danach wurden der Roboterarm des Shuttles sowie einige Komponenten in der Nutzlastbucht der Atlantis aktiviert. Nach einem kurzen Bewegungstest wurde mit den Kameras am Roboterarm der Zustand der Nutzlastbucht, der Crewkabine und der Vorderflügelkanten erstmals begutachtet. Die dabei gewonnenen Bilder ersetzten die Aufnahmen des bei ISS-Flügen üblicherweise durchgeführten Rendezvous Pitch Maneuvers (RPM).

Am 12. Mai 2009 wurde, wie seit STS-114 üblich, der Hitzeschild mit dem Orbiter Boom Sensor System (OBSS) untersucht. Diese Untersuchung wurde für diesen Flug jedoch ausgeweitet und fokussierte sich nicht nur auf die Vorderflügelkanten und die Nase der Raumfähre, sondern auch auf den unteren Hitzeschild und die Triebwerkssektion. Dies geschah ebenfalls, um das Fehlen des Rendezvous Pitch Maneuver (RPM) zu kompensieren. Bei der Untersuchung wurden in einem 50 cm langen Bereich am Flügelansatz leichte Oberflächenschäden gefunden, die vermutlich durch ein 106 Sekunden nach dem Start im Startvideo erkennbares herabfallendes Teil entstanden sind. Im Innern der Raumfähre wurden derweil Vorbereitungen für die Außenbordeinsätze getroffen. So wurden die Raumanzüge ausgepackt und für ihre ersten Einsätze vorbereitet, indem die Batterien aufgeladen und die Sauerstoffflaschen des Lebenserhaltungssystems befüllt wurden. Weiterhin wurde der Luftdruck im Innern des Shuttles von Normaldruck (1013 hPa) auf 703 hPa reduziert, sodass sich die Menge der im Körpergewebe der Raumfahrer gelösten Inertgase (hauptsächlich Stickstoff) entsprechend verringerte. Dies beugte der Dekompressionskrankheit während der Außenbordeinsätze vor und erlaubte, auf ein langes Voratmen von Sauerstoff zu verzichten. Weiterhin klappte man die Arbeitsbühne, auf welcher Hubble montiert werden sollte, von der Start- in die Arbeitsposition.

Am 13. Mai 2009 fand das Rendezvous statt. Bereits früh im Flugtag fanden zwei Triebwerkszündungen statt, eine weitere NC-Zündung und die im Vergleich dazu starke NH-Zündung, welche die Atlantis in 15,24 km Abstand zu Hubble brachte. Dort fand die letzte größere Triebwerkszündung, der TI-Burn statt, welcher die erste Phase des Rendezvous einleitete. Nach zwei kleineren Kurskorrekturen erreichte die Raumfähre eine Position einige hundert Meter unterhalb Hubbles. Scott Altman übernahm von dem Zeitpunkt an die manuelle Kontrolle über die Atlantis und flog diese nah an das Teleskop heran. Er flog anschließend ein Nickmanöver, sodass Megan McArthur das Teleskop mit dem Roboterarm ergreifen konnte. Sie bewegte den Arm anschließend so, dass Hubble auf der Arbeitsbühne befestigt und an die Stromversorgung des Shuttles angeschlossen werden konnte.

Die erste EVA durch John Grunsfeld und Andrew Feustel erfolgte am 14. Mai 2009 (7h 20m). Sie führten zunächst einige vorbereitende Aufgaben aus. Dazu gehörte unter anderem, eine kleine Fußhalterung am Ende des Greifarms anzubringen, damit Andrew Feustel diese besteigen konnte. Megan McArthur konnte so den Greifarm verwenden, um Andrew Feustel Zugriff auf die Arbeitsstellen zu gewähren. Während Andrew Feustel zur Position der WFPC-2 bewegt wurde, arbeitete John Grunsfeld in der Nutzlastbucht und öffnete die Verschlüsse des Kamerabehälters. Weiterhin montierte er eine Halterung, in der ausgebaute Geräte vorübergehend gelagert werden konnten.
Andrew Feustel begann mit den Arbeiten an WFPC-2, indem er einen Griff daran montierte. Während des Entfernens traten jedoch einige Probleme mit einer Schraube auf, die das sofortige Ausbauen des Gerätes verhinderten. Nachdem dieses Problem gelöst war, zog Andrew Feustel die Kamera aus dem Teleskop und brachte sie an der vorübergehenden Halterung an. Anschließend manövrierte ihn der Greifarm so, dass er die WFPC-3 aus ihrem Behälter entnehmen und in Hubble einstecken konnte. Während WFPC-2 in den Behälter ihres Nachfolgers geschoben wurde, bestand WFPC-3 einen Initialtest, bei dem lediglich geprüft wird, ob das Gerät aktiv war. Den Funktionstest, bei dem die von der Kamera gesendeten Basisdaten ausgewertet wurden, bestand sie einige Stunden später.
Die nächste Aufgabe bestand darin, die SIC&DH-Einheit auszutauschen. Andrew Feustel wurde dafür zu der Tür gebracht, an welcher die fehlerhafte Einheit montiert war. Während er den Schließbolzen löste und die Einheit demontierte, löste John Grunsfeld die neue SIC&DH aus ihrer Startposition und brachte sie zu Andrew Feustel. Bei ihm tauschten sie die Einheiten aus und installierten die jeweils erhaltenen Geräte an dieselben Positionen, an denen sie die anderen zuvor entnommen hatten. Auch die neue SIC&DH schloss ihren Initialtest sowie den darauffolgenden Funktionstest erfolgreich ab.
Da John Grunsfeld mit dieser Aufgabe schnell fertig war, montierte er den Soft Capture Mechanism an Hubble. Weil noch einige Zeit vorhanden war, holte er einige "Lock-over-center-kits" (Lock), welche als Vorbereitung für den dritten Ausstieg an einer von Hubbles Türen montiert wurden. Sie erlaubten ein schnelleres Öffnen der Tür. Während der Montage, welche erneut Andrew Feustel durchführte, kam es zu Schwierigkeiten mit einem Bolzen, weshalb von den drei geplanten Locks lediglich zwei installiert wurden. Die Montage des dritten Locks wurde zwar begonnen, jedoch später abgebrochen und dafür ein anderer, dem Lock ähnlicher Mechanismus, installiert.

Die zweite EVA unternahmen Michael Massimino und Michael Good am 15. Mai 2009 (7h 56m). Während Michael Good sich am Greifarm befestigte, öffnete Michael Massimino den Behälter, der die RSUs beinhaltete. Weiterhin montierte er ein Werkzeug für den Ausstieg. Michael Massimino begab sich dann zur Arbeitsstelle an Hubble, öffnete sie und bereitete sie auf die Arbeiten vor. Derweil entnahm Michael Good die erste Einheit aus dem Behälter und ließ sich zum Teleskop befördern. Dort löste er die alte Einheit und baute die neue problemlos ein. Er flog zurück, verstaute die alte Einheit und entnahm eine weitere. Diese Einheit sollte sich jedoch als fehlerhaft herausstellen und war somit in Hubble unbrauchbar, weshalb sie wieder verstaut und durch eine Reserveeinheit ersetzt wurde. Die letzte Einheit ließ sich wieder problemlos installieren. Alle drei neuen RSUs bestanden den Initial- und später den Funktionstest.
Trotz der fortgeschrittenen Zeit entschied man sich dafür, auch den Austausch des ersten Batteriemoduls durchzuführen. So wurde Michael Good zur neuen Arbeitsposition manövriert, wo er die Tür öffnete und das Batteriemodul vom Türinneren löste. Nachdem er die elektronischen Verbindungen getrennt hatte, flog er zu Michael Massimino und tauschte das alte Modul gegen das neue aus. Er montierte anschließend die Batterie und schloss sie an. Sie bestand ebenfalls beide Tests.

Die dritte EVA durch John Grunsfeld und Andrew Feustel erfolgte am 16. Mai 2009 (6h 36m). Beide Astronauten arbeiteten daran, COSTAR gegen den Cosmic Origins Spectograph (COS) auszutauschen. Diese Arbeiten verliefen ähnlich wie der Austausch der WFPC-2 gegen WFPC-3 und konnten ohne Probleme durchgeführt werden. COS bestand den Initial- und den Funktionstest.
Anschließend begannen die Astronauten mit den Arbeiten an der Advanced Camera for Surveys, welche als erstes Instrument überhaupt während eines Außenbordeinsatzes repariert werden sollte. John Grunsfeld, der alle Arbeiten an ACS durchführte, musste dafür einen Teil der äußeren Verkleidung des Gerätes entfernen, was nur durch Herausschneiden möglich war. Er brachte ein Gerät am Gehäuse an, welches ein Loch in die Verkleidung schnitt und die dabei entstandenen Restmaterialien einbehielt, sodass diese keine Gefahr mehr für die Raumfahrer darstellten. Anschließend brachte John Grunsfeld ein Werkzeug an der Deckplatte der eigentlichen Arbeitsposition an. Dieses Werkzeug ermöglichte ihm die Entfernung von 32 Schrauben, welche sonst nicht hätten eingefangen werden können. John Grunsfeld nutzte danach ein spezielles Handwerkzeug und entfernte die vier Steckkarten des Elektroniksystems der Kamera. Diese Karten hatten im Januar 2007 einen Kurzschluss erlitten und waren seitdem funktionsuntüchtig. Beim Entfernen der Karten traten keine Schwierigkeiten auf, sodass John Grunsfeld am Ende dieser Aufgabe eine Stunde vor dem Zeitplan lag. So wurde dem Duo die Erlaubnis erteilt, auch mit dem zweiten Teil der ACS-Arbeiten zu beginnen. Diese Arbeiten waren nicht für diesen Ausstieg vorgesehen und lagen auch in der gesamtem Missionsplanung nach dem SIC&DH-Ausfall nur noch optional im Flugplan. So setzte John Grunsfeld eine Box in den Steckplatz ein, welche die gleichen Komponenten enthält, die auch auf den Karten waren. Er legte ebenfalls die Stromversorgung, die für die Nutzung der Box nötig ist. Sie schlossen anschließend die ACS-Arbeiten ab und begannen, den Arbeitsplatz zu verlassen.

Die vierte EVA unternahmen Michael Massimino und Michael Good am 17. Mai 2009 (8h 02m). Während des Ausstiegs sollte der Space Telescope Imaging Spectograph (STIS) durch eine Reparatur reaktiviert werden. Die Astronauten mussten dafür einige Klemmen am Gehäuse sowie eine Halterung von der Deckplatte entfernen. Die Entfernung eines Bolzens der Haltestange war jedoch nicht möglich, sodass Michael Massimino diese schließlich herausbrechen musste. Er installierte anschließend ein Werkzeug auf der Deckplatte, welches die insgesamt 111 Schrauben einfing, die für den Zugang zum Geräteinneren entfernt werden mussten. Danach wurde auch bei STIS die Elektronikkarte entfernt und durch eine neue ersetzt. Wegen der stark fortgeschrittenen Zeit wurde die geplante Installation einer NOBL-Isolierungsmatte nicht mehr durchgeführt.

Nach dem Ende der vierten EVA wurde Hubble um 180° gedreht, wodurch die bisher ungesehene Rückseite des Teleskops sichtbar wurde. Es zeigte sich, dass die Isolierung an der Stelle, die ursprünglich im vierten Ausstieg hätte erneuert werden sollen, stark beschädigt war. Es wurde entschieden, diese Aufgabe während des fünften Ausstiegs durchzuführen.

Die fünfte und letzte EVA wurde wieder durch John Grunsfeld und Andrew Feustel am 18. Mai 2009 (7h 02m). Die Astronauten arbeiteten an der Auswechslung des zweiten Batteriemoduls. Die dafür benötigten Arbeiten deckten sich mit denen an ihrem Gegenstück und konnten ohne Probleme durchgeführt werden. Die Batterie bestand den Initialtest. Die Astronauten begannen anschließend, einen der drei Fine Guidance-Sensoren aus seiner Halterung zu entfernen, sodass ein neuer an seiner Position montiert werden konnte. Die Arbeiten waren vergleichbar mit dem Austausch der WFPC-2 und wurden problemlos abgeschlossen.
Da diese Aufgaben bereits nach weniger als drei Stunden beendet waren, wurde die Erlaubnis erteilt, die drei NOBLs zu installieren. Vor der Installation der neuen Isolierungen mussten jedoch zunächst jeweils die alten Matten entfernt werden. Dafür mussten die Rückhalterungen und Verschnürungen der Matten gelöst und zum Teil durchtrennt werden. Während dies bei der ersten der drei Matten problemlos funktionierte, machte die zweite mehr Schwierigkeiten. Nachdem diese Matte ersetzt worden war, konnte mit der dritten Matte fortgefahren werden. Anschließend konfigurierten John Grunsfeld und Andrew Feustel den Greifarm sowie die Nutzlastbucht für die Heimreise. Dabei kam es zu einem kleinen Unfall mit dem Teleskop: John Grunsfeld bereitete die Arbeitsbühne gerade auf das Zusammenklappen am nächsten Flugtag vor, als er versehentlich mit der Übertragungsantenne des Teleskops für niedrige Frequenzen zusammenstieß und diese beschädigte. Sie funktionierte danach zwar noch, jedoch entschloss man sich kurzfristig dazu, den Schaden sofort zu beheben.

An 19. Mai 2009 wurde Hubble vom Shuttle abgetrennt. Megan McArthur ergriff dazu Hubble mit dem Roboterarm, entfernte es von der Wartungsplattform und hob es aus der Nutzlastbucht hinaus. Nachdem das Schutzschott des Spiegels geöffnet worden war, wurde das Teleskop um 12:57 UTC losgelassen. Anschließend wurde die Atlantis langsam vom Teleskop wegbewegt, bis sie weit genug entfernt war, um ihr Triebwerk zu aktivieren und sich weiter zu entfernen. Die Besatzung begann danach mit der Spätinspektion des Hitzeschildes und dem Einklappen der Wartungsbühne als Vorbereitung für die Landung. Durch eine Triebwerkszündung wurde das Perigäum der Bahn auf 300 km abgesenkt, um so die Gefahr durch Mikrometeoriten und Weltraummüll zu verringern

Wegen schlechten Wetters wurde die Landung um zwei Tage verschoben. Da das Wetter weiterhin keine Landung in Florida erlaubte, wurde die Atlantis zur Edwards AFB umgeleitet.